ELISA試劑盒 "一"問"一"答——樣本篇

  問：我能否不用推薦的收集方法來收集血漿?

  答：每一次按照推薦步驟操作的測定都是經過驗證可行的。在某些測定中有些抗凝劑是不被推薦的。具體請參看說明書。

  有些待檢測的分析物也存在于血小板中，因此，推薦使用低血小板血漿。正確的收集操作方法請參看說明書。

  問：我是否可以將試劑盒中說明書的樣品數(shù)據(jù)作為參考?

  答：說明書中的樣品數(shù)據(jù)是從有限的檢測個體中得出，只能作為大概的指導。

  問：我能否使用自己的稀釋液或者緩沖液?

  答：每個試劑盒中都含有按配方配制的與特異性樣品種屬相配套的稀釋液，以確保待檢測的樣品被正確稀釋。

  每個試劑盒中都含有按配方配制的與特異性樣品種屬相配套的稀釋液，以確保待檢測的樣品被正確稀釋。

  問：我是否必需按照試劑盒內說明書中的方法準備樣品?

  答：推薦的樣品準備方法是經過實驗驗證的佳的方法，所以推薦按照說明書上的方法制備樣品。

  問：我使用對照的檢測結果都在范圍外，為什么?

  答：如果使用對照，其濃度應該是在某一特定范圍內。如果對照值在范圍外，則是無效測定。確定對照具有重復性。

  問：我沒有足量的稀釋液去稀釋所有的樣品，怎么辦?

  答：試劑盒內提供說明書中所的足量的稀釋液。能保證所有的標準品和樣品檢測兩次。

  如果沒有推薦的稀釋度，或者需要大量稀釋，請在實驗前計算出所需的稀釋液總量，然后聯(lián)系我們獲取額外的稀釋液。

  問：我是否可以省略說明書中標準曲線的標準品值?

  答：不可以。樣品值必需由每次檢測的標準曲線決定。

  問： 如果是手繪標準曲線，我怎樣決定樣品濃度?

  答：要決定每個樣品的濃度，首先找到Y軸的光度值或者相對光單位，然后作水平線至標準曲線。在交點處，作垂線至X軸，讀取相應濃度。

  問： 我檢測到的樣品值在測定實驗的動態(tài)范圍之外，我是否可以用這些數(shù)值?

  答：只有隨標準曲線降低的樣品值才被推薦使用。在標準曲線范圍外的值都是非線性的，會導致錯誤的外推值。

  如果測定的樣品值比高的標準品的值還要高，則此樣品需要進一步的稀釋并重新進行檢測。

  如果測定的樣品值遠低于測定范圍，則樣品被認為是無法被檢測。

  問：我的樣本經不同梯度稀釋，計算得到的樣本濃度差異較大

  答：血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體接觸，稀釋后，干擾蛋白也稀釋，影響較小。當某兩個梯度稀釋后，計算得出的樣本濃度接近時，則認為該稀釋梯度時，樣本值接近真實值。

  問：標曲和樣本都顯色，但復孔的CV大

  答：這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關了。移液器的使用維護不規(guī)范，就會造成移液的誤差較大;實驗者自身的操作習慣、加樣的一致性對復孔的CV也有很大影響。

  掌握移液器的正確使用和維護。關于個人的操作可練習移液動作、加快速度，確保移液的度。

  問：我的本底偏高，樣本值測不到

  答：標曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候，本底過高會掩蓋目的信號，導致無法測到樣本值。

  在加入TMB顯色后，需實時觀察標曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍色，即可終止反應。

  問：我的標曲和樣本均不顯色

  答：在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導致顯色偏弱。

  推薦孵育階段，使用ELISA專用的微孔板振蕩器，調至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手，一定要做好標記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。

  問：我的標準曲線看上去還不錯，但是卻沒有達到我預期的結果，為什么?

  答: 樣品可能不含有待分析物。稀釋液的影響可能遮蔽了檢測。確保采用說明書推薦的稀釋度。

  如果確實采用的是推薦的稀釋度，則檢查稀釋操作是否正確。過度稀釋將導致樣品值低于標準曲線范圍。

  問：我怎樣補償樣品的稀釋度或者濃縮度?

  答：如果樣品是稀釋型的，標準曲線所讀取的值必需乘以稀釋度。

  如果樣品是濃縮型的，標準曲線所讀取的值必需除以濃縮比。

  小建議：

  1.確定待檢測的樣品在收集和制備時保證無菌操作。

  2.如果要檢測多個樣品，將樣品隔離并標記清楚以防相互污染。

  3.檢測前，將樣品離心除去顆粒。將樣品轉移至新的離心管內，混合均勻。

  4.在混合樣品時，使用容積至少比樣品體積大50%的離心管以保證混合充分。

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