古朵資訊| ELISA實驗中標曲和樣本的顯色問題

  ELISA實驗是我們科研實驗中經常使用的實驗方法，看似簡單其實有許多需要我們去注意的，今天古朵生物技術小編就和大家介紹下實驗中常見的標曲和樣本的顯色問題。

  一、標曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色。

  溶解標準品以及倍比稀釋時，未渦旋震蕩或不夠充分。標準品溶解時，需要渦旋震蕩，以保證充分溶解。在做倍比稀釋時，也要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復吹打，效率較低、效果也不一定好。

  二、標曲和樣本均不顯色。

  在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導致顯色偏弱。推薦孵育階段，使用ELISA專用的微孔板振蕩器，調至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結合效果。

  如果排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。所以在實驗過程中，一定要做好標記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。

  三、標曲顯色，樣本不顯色。

  到這種情況，很多人覺得是試劑盒問題，這其實是一個誤區。任何一種實驗方法，都有其局限性，當樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強，就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度的方法，與不同技術結合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測靈敏度。如采用信號增強劑的高敏ELISA、ECL為底物的化學發光ELISA、采用熒光法檢測的ELISA、結合PCR擴增的免疫PCR等等。

  對于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度，只能說可以提高樣本的可測率，并使結果加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低，甚至低于標準品濃度的S7點，雖然可以計算得到數值，但實際上這個數值的可信度已經降低了。而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標曲范圍內，得到的數值也加可信。

  四、標曲和樣本都顯色，但復孔的CV大。

  這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關了。移液器的使用維護不規范，就會造成移液的誤差較大。實驗者自身的操作習慣、加樣的一致性對復孔的CV也有很大影響。個人的操作可以在空白板上練習移液動作，或者在幾十個離心管中加入相同體積的水，通過電子天平稱量，檢驗移液的度。同時還需練習加快加樣速度，減少從個樣本到后一個樣本加樣時間過長導致的差異。

  ELISA實驗中有關標曲和樣本的顯色問題主要就是以上4種，當然還會存在其他的問題，在這里就不一一介紹了，大家在操作過程中要細心謹慎，防止出現以上的問題。

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