2、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。
3、加標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）；空白對照孔不加。
4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機(jī)按說明書操作洗板）。
6、加酶標(biāo)工作液：每孔加入酶標(biāo)工作液50μL，空白對照孔不加。
7、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
8、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機(jī)按說明書操作洗板）。
9、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B液 50μL，平板混勻器混勻30s（或用手輕輕震蕩混勻30s），37℃避光顯色15min。
10、終止：取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11、測定：以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長測量各孔的吸光值（OD值）。
12、計算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。終濃度為實(shí)際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。